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本试剂盒用于定量检测血清、血浆、组织、细胞、食品或保健品等样品中的超氧化物歧化酶(SOD)活力。

超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)是含金属辅基的酶，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶，由于超氧自由基是不稳定的自由基，寿命极短，SOD活性一般用间接方法测定，并利用各种呈色反应来测定SOD活力，其中显色剂有NBT(四氮唑蓝)、WST-1、WST-8等。

邻苯三酚比色法也叫邻/连苯三酚自氧化法或邻/连苯三酚自氧化抑制法，其检测原理是邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出超氧阴离子自由基，进而生成黄色的中间产物；在自氧化过程的初始阶段，黄色产物的积累在滞后30~45s后与时间呈线性关系，黄色产物在325nm处有强吸收，在有SOD存在时，由于SOD能催化超氧阴离子自由基与氢离子结合成氧气和过氧化氢，从而阻止了中间产物的积累，因此可根据SOD抑制邻苯三酚自氧化能力测定SOD的酶活力。

• 蒸馏水、生理盐水或磷酸缓冲液
  
• 离心机、离心管、水浴锅或恒温箱、小试管、分光光度计、石英比色杯

• 待测样品-70℃可保存1个月，需注意反复冻融会导致SOD部分失活。
  
• 细胞或组织等样品制备时不易采用含有Triton X-100等去垢剂的溶液。
  
• 抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid、5mM GSH以及维生素C都会使测定出来的吸光度显著升高，应设法除去或不添加相关成分。
  
• 对于植物样品，研磨处理应迅速，以免SOD酶活下降，尽量在冰浴条件下处理样品。
  
• 在邻苯三酚自氧化速率与酶活力测定过程中，记录时间应准确一致，以保证吸光度读数的准确性。
  
• 反应温度、pH和邻苯三酚的浓度都对结果有影响，故应严格控制。
  
• 所有实验器材必须清洁干燥。
  
• SOD对邻苯三酚自氧化速率的抑制率在5min内呈线性。
  
• 邻苯三酚自氧化速率以0.06为标准，可控制在0.06～0.07之间，可通过适当增减邻苯三酚的用量加以调节。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 准备样品：
  
  • 血浆或含红细胞的样品：如果测定血浆中SDO活性，则从待测样品中分理出血清或血浆，不应有溶血，如果含有红细胞应先4℃ 3000r/min离心5min，转移上清至另一新的离心管中，适量生理盐水稀释后待测，如超过检测范围，用磷酸缓冲液(pH7.8)稀释后再测。如果需要测定红细胞中SOD活性，则应取一定体积的新鲜血液或肝素抗凝血，混匀，3000r/min离心5min，弃上清，沉淀用ACK红细胞裂解液使其充分溶血，3000r/min离心5min，上清液即为红细胞SOD粗提液。
    
  • 组织样品：动物用含有20U/mL Heparin的生理盐水(0.9% NaCl containing 20U/mL Heparin)灌流清除血液后获取组织样品，按照每100mg组织加入500μL磷酸缓冲液(pH7.8)的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，离心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。
    
  • 细胞样品：对于贴壁细胞，由于后续用于酶活性的测定，避免使用胰酶消化细胞。可以使用细胞刮或EDTA处理细胞并收集细胞，细胞用无菌的PBS或生理盐水洗涤1次，按照每10⁶细胞加入300～500μL磷酸缓冲液(pH7.8)的比例，用玻璃匀浆器在4℃或冰浴匀浆，离心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的测定。
    
  • 植物样品：准确称取植物材料(果肉或者去叶脉的叶片)0.4g，剪碎，置于4℃预冷的研钵或匀浆器中，加入预冷磷酸缓冲液(pH7.8) 1mL，低温研磨至匀浆后转移至离心管，用3mL磷酸缓冲液冲洗研钵或匀浆器并转入离心管，加总体积至4mL，离心20min，上清液为酶提取液，可用于SOD的检测。
    
  • 澄清液体样品可取原液直接测定，浑浊液体样品可经离心15min，再取上清液测定。
    
  • 样品准备完毕后可以用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，通常10～20μg蛋白的细胞或组织匀浆液样品中的SOD平均活力约1个活力单位左右(不同细胞和组织的差异会比较大，该活力范围仅作为初步的参考)。每种样品准备20～100μg蛋白量通常已经足够用于后续检测，根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用相关提取液适当稀释样品；例如小鼠肝脏组织10%匀浆液(组织和匀浆液的重量比为10%)上清，通常需要稀释10～100倍，准备好的样品如果当天测定，可以冰浴保存；如果当天不能完成测定，可以-20℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
• 邻苯三酚自氧化速率测定：在25℃左右，于两个离心管中按下表依次加入各试剂。
  

  成分(mL)	自氧化空白管	自氧化测定管
  SOD Assay Buffer	0.94	0.94
  蒸馏水	0.8	0.8
  空白对照液	0.06	-
  邻苯三酚显色液	-	0.06

  加入显色液后立即混匀倾入1cm比色皿内，在325nm波长下测定0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s两个管的吸光值，计算线性范围内每分钟吸光度的增值(自氧化测定管-自氧化空白管)，即邻苯三酚的自氧化速率ΔA325(min^-1)，该试剂盒经测定ΔA₃₂₅(min^-1)约为0.060，可通过调节邻苯三酚的加入量控制自氧化速率在每分钟0.060～0.07。
  
• 样品SOD抑制邻苯三酚自氧化速率测定：按照下表依次加入相应成分，加入显色液后立即混匀倾入1cm比色皿内，在325nm波长下测定两个管的吸光值，使抑制邻苯三酚自氧化的速率约为1/2邻苯三酚的自氧化速率，即ΔA'₃₂₅(min^-1)为0.030。
  

  成分(mL)	样品空白管	样品测定管
  SOD Assay Buffer	0.94	0.94
  蒸馏水	0.72	0.72
  样品提取液	0.08	0.08
  空白对照液	0.06	-
  邻苯三酚显色液	-	0.06

25℃时，在1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为1个活性单位(U)，即在325nm处为0.03OD/min为一个活力单位。若自氧化速率为35%～65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液用量。